Fluorestseeruvad valgud

Geneetiliste mutatsioonide varieeruvuse illustratsioon, mis kujutab San Diego rannavaadet päikeseloojangul. Kasutatud on elusaid baktereid, mis ekspresseerivad 8 eri värvi fluorestseeruvat valku (GFP ja dsRed derivaadid)

Fluorestseeruvad valgud on valgud, mis helendavad, kui neid valgustada ultraviolettvalgusega või valgusega suuremal lainepikkusel. Esimesena eraldati roheline fluorestseeruv valk (GFP – green fluorescent protein). Sellel on kaks ergastuspiiki: 395 nm ja 475 nm. Emissioonimaksimum on 509 nm, mis paikneb rohelise valgusspektri alumises osas.

Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura ja Martin Chalfie said 2008. aastal Nobeli keemiaauhinna rohelise fluorestseeruva valgu avastamise ja arendamise eest.

Ajalugu

Washingtoni Ülikooli teadlased Osamu Shimomura ja Frank Johnson eraldasid 1961. aastal esimestena biohelendava valgu. Valk eraldati Aequrea victoria meduusist ning see sai nimeks aequorin. Aequorin kiirgab UV-valguses sinist värvust. Aequrin'i isoleerimise ajal avastati veel teine valk, GFP, millel on nõrk sinine kiirgus, kuid mis on võimeline helendama roheliselt, kui seda valgustada UV-valgusega.

Kasutamine

30 aastat hiljem, 1992. aastal, kui Douglas Prasher teatas GFP kloonimisest ja nukleotiidsest järjestusest, hakkasid molekulaarbioloogid nägema GFPs kasulikku tööriista. Teadlased mõistsid, et see on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. GFP-d on modifitseeritud, et saada veel teisigi helendavaid valke.

GFP derivaadid ja teised fluorestseeruvad valgud

Rohelisest fluorestseeruvast valgust on tehtud palju derivaate, sest sel on lai kasutusala ja arenev teadus vajab uusi töövahendeid. Derivaatide fluorestsentsspekter katab peaaegu terve nähtava spektri ulatuse. Lisaks Aequrea victoria'le kasutatakse ka teisi organisme, mille geenijärjestust kasutades on võimalik eraldada fluorestseeruvaid valke. Fluorestseeruvad valgud, mis emiteerivad oranži ja punast, on eraldatud õisloomade (Anthozoa) klassist, ainuõõssete (Cnidaria) hõimkonnast pärit isenditelt.

Rohelised fluorestseerivad valgud

GFP toodab küll väga tugevat helendust ja on väga stabiilne valk, aga selle ergastusmaksimum on lähedal ultravioletsele valgusele ja seetõttu võib GFP-ga visualiseerimine kahjustada elavaid rakke. Ühe punktmutatsiooniga seriini 65. positsioonis, mis muudab selle treoniiniks, on ergastusmaksimum viidud 488 nm juurde ja emissioonimaksimum on 507 nm. EGFP (enhanced green fluorescent protein) on kõige enam kasutatav roheline fluorestseeruv valk, mida on laialdaselt saadaval mitmesugustes vektorites. Lisaks on EGFP vaadeldav filtritega, mis on juba laialdaselt kasutatavad.

Emerald on fotostabiilne ja erk roheline fluorestseeruv valk, aga kaubandusliku allika puudumine on selle kasutamist piiranud. Ergastusmaksimum 487 nm, emissioonimaksimum 509 nm.

GFP2 on roheline fluorestseeruv valk, milles fenüülalaniinijääk on 64. positsioonis leutsiini vastu vahetatud. Ergastuspiik on 400 nm juures.

ZsGreen1 on korallrahust pärit valk. Seda on tutvustatud ka kui asendust EGFP-le. Kui ZsGreen1 ekspresseerida imetaja rakus, siis sarnaneb see väga EGFP-ga. Ergastuspiik on 493 nm ja emissioonipiik 505 nm juures.

Kollased fluorestseerivad valgud

YFP (yellow fluorescent protein) on GFP geneetiline mutant, mis on saadud Aequorea victoria valgust. Sarnaselt GFP-ga on YFP kasulik tööriist raku- ja molekulaarboloogias. Ergastusmaksimum 514 nm ja emissioonimaksimum 527 nm.

Perekonnale pandi alus pärast rohelise fluorestseeruva valgu kristallstruktuuri avastamist, kui leiti, et rohelise fluorestseeruva valgu treoniini 203. jääk on kromofoori lähedal. Mutatsioonid selles jäägis tagavad stabiilse oleku ergastatud dipoolil.

EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) on üks eredamaid ja laialdaselt kasutatav fluorestseeruv valk. On tundlik happelisele pH-le ja kaotab umbes 50% fluorestsentsist pH 6,5 juures. Ergastuspiik on 514 nm ja emissioonipiik 527 nm juures.

Citrine on väga erk ja võrreldes EYFP-ga on palju vastupanuvõimelisem fotopleegitamisele, happelisele pH-le ja teistele keskkonnamõjudele. Ergastusmaksimum 516 nm juures ja emissioonimaksimum 529 nm juures.

Venus on kiiremini formeeruv ja väga erk kollaselt fluorestseeruv valk võrreldes eelmistega. Ergastusmaksimum on 515 nm juures ja emissioonimaksimum 528 nm juures.

ZsYellow1 on kollaselt fluorestseeruv valk, mis on kloonitud Zoanthus'e liigist, õisloomade (Anthozoa) klassist, ainuõõssete (Cnidaria) hõimkonnast. Ergastusmaksimum 529 nm ja emissioonimaksimum 539 nm.

Sinised ja tsüaansinised fluorestseeruvad valgud

Siniselt fluorestseeruv valk on ekspresseeritud hariliku müürlooga lehe õhulõhedes. Pilt on tehtud laserskaneeriva konfokaalmikroskoobiga.

Selleks, et saada GFP-st siniseid (BFP – blue fluorescent protein) ja tsüaansiniseid (CFP – cyan fluorescent protein) fluorestseeruvaid valke, on vaja rohelise fluorestseeruva valgu türosiini 66. jääk modifitseerida histidiiniks või trüptamiiniks. Mõlemad variandid fluorestseeruvad nõrgalt ja vajavad veel teist mutatsiooni, et voltumine oleks efektiivsem ja helendus seetõttu tugevam. EBFP (enhanced blue fluorescent protein) ja ECFP (enhanced cyan fluorescent protein) on ainult 25–40% sellest helendusest, mida suudab EGFP toota. EBFP ja ECFP vaatlemiseks on vaja erilisi filtreid. Ergastuspiigid on vastavalt 383 ja 439 nm juures ning emissioonipiigid 445 ja 476 nm juures.

AmCyan1 on tsüaansiniselt fluorestseeruv valk, mis eraldati korallrahust Anemonia majano. Imetajas ekspresseerimiseks optimeeriti AmCyan1 inimese koodonitega, et saada suurem helendus ja resistentsus fotopleegitamisele. Ergastuspiik on 458 nm juures ja emissioonipiik 489 nm.

Cerulean on tõhustatud vorm ECFP-st, et saada kõrgem ekstinktsioonitegur ja paranenud kvantitatiivne saagis. Ergastusmaksimum 433 nm ja emissioonimaksimum 475 nm.

Oranžid ja punased fluorestseeruvad valgud

Fluorestseeruvate valkude konstrueerimise suurim eesmärk on punaste valkude tootmine, mis oleksid võrdväärsed või paremad kui on EGFP. Punased fluorestseeruvad valgud on vaadeldavad juba olemasolevate mikroskoopide ja nende lisadega. Punaste fluorestseeruvate valkudega on võimalik vaadelda tervet looma, sest need on punasele valgusele paremini läbistatavad kui teistele valgustele. Meduusist Aequorea victoria eraldatud rohelise fluorestseeruva valgu mutant punane fluorestseeruv valk pole olnud nii edukas.

DsRed on oranž fluorestseeruv valk, mis eraldati Discosoma striata'st õisloomade (Anthozoa) klassist. Valgul esineb mitmeid probleeme: liiga aeglane formeerumine, tetrameer, võib formeerida suuri agregaate elusrakkudega, tihti ka toksiline. Ergastusmaksimum 558 nm ja emissioonimaksimum 583 nm.

DsRed2 on DsRed-ist mutatsioonide abil saadud oranž fluorestseeruv valk. Sellel vähendati toksilisust, see formeerub kiiremini ja ei moodusta agregaate. Ergastusmaksimum 563 nm ja emissioonimaksimum 582 nm.

DsRed-Express on edasiarendus eelmistest. Sellel on tugevam helendus ja kiirem formeerumine. Ergastusmaksimum 555 nm ja emissioonimaksimum 584 nm.

RedStar on pärmi jaoks loodud punane fluorestseeruv valk. Sellel on veelgi kiirem formeerumine ja tugevam helendus.

HcRed1 on punane fluorestseeruv valk, mis isoleeriti Heteractis crispa'st, meriroosiliste (Actiniaria) seltsis, õisloomade (Anhozoa) klassist. Laialt kättesaadav ja kasutatav just imetajate uurimisel. Ergastuspiik on 588 nm juures ja emissioonipiik 618 nm juures.